Tips bij Donkerveld Microscopie

In de jaren 1840 waren diatomeeën (algen) de ultieme testobjecten voor lichtmicroscopen met name de soort die toen bekend stond als Navicula Spencerii. Deze diatomeeën zijn vernoemd naar Charles Spencer, de New Yorkse lensmaker wiens lenzen deze diatomeeën konden oplossen strepen. Het bleek dat het gebruik van schuin licht nodig was om de striae op te lossen.

Schuine verlichting was de eerste stap in de richting van donkerveldmicroscopie. In donker veld, licht lijkt uit het monster te stralen terwijl de rest van het veld zwart is. Resolutie is als goed als dat in helder veld terwijl het contrast wordt verbeterd.

Syfilis heeft darkfield populair gemaakt. Schaudinn ontdekte Treponema pallidum – de syfilis-spirocheet – in 1905 met behulp van donkerveldmicroscopie. Dit gepromoot het gebruik van donker veld door de medische professie en vervolgens door biologen in het algemeen.

Verschillende vormen van Dark Field

De beste exemplaren voor donker veld zijn die met verspreide brekende objecten ongeveer met lege ruimte ertussen. Er treedt geen donker veld op als objecten te druk of te vol zijn als een dik, vast exemplaar licht in de microscoop verandert. Zeer dunne histologische secties kan worden gebruikt als het niet gekleurd is of als alleen bepaalde onderdelen gekleurd zijn, zoals bij zilvervlekken. Biologische vloeistoffen van dieren en planten, celculturen, microben, voedingsmiddelen, vezels, kristallen, colloïden en submicroscopische deeltjes zijn allemaal geschikt voor donkerveldmicroscopie. Preparaten van autoradiografie en goudlabeling zijn ook geschikt.

Donkerveld condensors

Donkerveld is de enige breedveldmethode die we zullen bestuderen maakt niet strikt gebruik van Köhler-verlichting. In donkerveldmicroscopie, geen direct licht van de condensor komt de objectieflens binnen. Alleen licht dat wordt weerspiegeld, gebroken of afgebogen door het monster komt binnen objectief. De donkerveldcondensor produceert een cirkel van licht. Dit licht staat in een extreem schuine hoek ten opzichte van het oppervlak van de microscoopglaasje.

Dit schuin licht komt tot een focus op het preparaat. Het wijkt dan zo af sterk dat er geen direct licht in het objectief valt (figuur 9.1). Dit type van verlichting is een holle lichtkegel. Die schuine verlichting gebruikt door de oude microscopisten om N. Spencrii op te lossen, kwam alleen van een richting. Dit effect werd verkregen door de spiegel van de microscoop sterk naar één kant te kantelen.

De donkerveldcondensor zorgt voor schuine verlichting van 360 graden rond de exemplaar. De numerieke apertuur van de condensor moet groter zijn dan de numerieke opening van de objectieflens om te voorkomen dat direct licht het objectief binnendringt. Dit is geen probleem voor droge objectieven met een lage vergroting als er een 0,95 NA condensor is gebruikt. Dit is echter een probleem voor hoge NA-objectieven. Hier moet de condensor een zeer hoge numerieke apertuur zoals 1,45 hebben en worden gebruikt met een objectief  van niet meer dan 1,25 NA.

Donkerveldcondensatoren met lage vergroting

Een donkerveldcondensor met lage vergroting kan niets meer zijn dan een gewone helderveld-condensor met een ondoorzichtige schijf met de juiste diameter aan de voorkant van het brandpuntsvlak. De diameter van de ondoorzichtige schijf moet net groot genoeg zijn om dit te voorkomen direct licht dat het objectief binnenkomt. Dit betekent natuurlijk dat grotere schijven zijn vereist voor doelstellingen van hogere NA.

Veel microscoopfabrikanten produceren een “universele” condensor die een of meer donkerveldschijven heeft die overeenkomen met de doelstellingen van verschillende NA. De schijnbare grootte van een ondoorzichtige schijf kan groter of kleiner worden gemaakt door verhogen of verlagen van de condensor. Eén schijf kan dus nuttig zijn voor een klein aantal objectieve NA’s. Als de condensor een NA groter dan 0,95 heeft, betere resultaten bij laag vergroting kan worden bereikt als de condensor op de slede wordt gesmeerd, ook al is de objectief wordt droog gebruikt.

U kunt uw eigen donkere veld-ondoorzichtige schijf maken voor objectieven met een laag vermogen, zoals volgt:

1. Stel Köhler-verlichting in
2. Observeer het objectief achterste brandpuntsvlak
3. Pas de diafragma-iris aan zodat deze net buiten de objectiefopening past
4. Meet de diafragma-diafragma
5. Maak een ondoorzichtige schijf van deze diameter
6. Plaats de schijf onder de condensor zo dicht mogelijk bij de iris van de condensor
7. Pas de grootte van de schijf aan: als het veld grijs is, is de schijf te klein, als het monster dat kan niet worden verlicht de schijf is te groot.

Donkerveldcondensors met hoog numeriek diafragma

De eerste condensor speciaal gemaakt voor donkerveld was geproduceerd door Francis H. Wenham en George Shadbolt in 1855.

Deze condensor gebruikte een parabolische glazen reflector om een holle lichtkegel. In tegenstelling tot een brekende condensor, een reflecterende condensor produceert geen chromatische aberraties en een parabolische vorm minimaliseert sferische aberraties. Het resultaat is een meer fijn gefocuste lichtvlek. Andere donkerveldcondensor ontwerpen ontstaan door de jaren heen. Figuur 9.3 en Tabel 9.1 beschrijf enkele van de meest voorkomende.

1. Paraboloïde, enkel reflecterend type.
2. bicentrisch of bisferisch, dubbel reflecterend type
3. Cardioïde, een bolvormig en een cardiodiaal reflecterend oppervlak
4. Spot Ring, dubbele reflectie van maximaal diafragma

De noodzaak om de objectieve NA lager te houden dan de condensor NA leidde tot de productie van steeds hogere NA-condensors en de introductie van de “trechter stop” voor de objectieflens. De trechterstop is een trechtervormige kegel die erin wordt gestoken de objectieflens om het diafragma te beperken. Moderne objectieflenzen gebruiken geen trechterstops.

In plaats daarvan hebben sommige hoge NA-olieobjectieven een irisdiafragma ingebouwd. Deze iris is gebruikt om de NA van de objectieflens te verminderen.

Donkerveldcondensors met hoge vergroting moeten altijd gebruik maken van een dekglas op het preparaat i.c.m. olie-immersie. Dit komt omdat de invalshoek van het licht dat de bovenkant van de condensor verlaat, is veel groter dan de kritische hoek voor glas ten opzichte van lucht; er komt dus geen licht uit de condensor totdat er immersieolie op het oppervlak is aangebracht.

Kritische hoek in donkerveldmicroscopie

Kritische hoek is belangrijk in een donker veld. De donkerveldcondensor produceert a

zeer schuine lichthoek. Als deze hoek groter is dan de kritische hoek op een willekeurig raakvlak,  de verlichting wordt volledig intern gereflecteerd. Om deze reden is het soort onderdompelings-medium is belangrijk. De kritische hoek voor glas naar lucht is 41 graden en voor glas tot water is het 61 graden.

Donkerveldcondensors met laag vermogen werken prima voor specimens in water. Een krachtige donkerveldcondensor is mogelijk niet bruikbaar bij ondergedompeld water exemplaar om bovengenoemde reden. Het is altijd het beste om de donkerveldcondensor onder te dompelen de dia met olie, zelfs voor  donkerveldcondensors met laag vermogen, zolang de kritische hoek maar is niet overschreden.

Methoden voor donkerveldmicroscopie

Hierin worden specifieke methoden voor donkerveld en enkele van de valkuilen gepresenteerd sectie.

Vereisten voor donker veld

Een paar eenvoudige voorwaarden zullen de meeste problemen in het donker elimineren veldmicroscopie:

1. Zorg ervoor dat uw condensor een groter numeriek diafragma heeft dan het hoogste vermogen doel dat je gaat gebruiken.
2. Donker veld vereist een zeer heldere lichtbron. Verwijder alle neutrale dichtheid en gekleurd filters van het belichtingstoestel.
3. Zorg ervoor dat uw glasplaatjes niet te dik of te dun zijn, vooral als u dat wel bent met behulp van een hoge NA donkerveldcondensor. Donkerveldcondensors met een hoog NA-gehalte hebben een vast brandpunt lengte waarop ze optimaal werken. De fabrikant kan een dikte van het glasplaatje aanbevelen of deze waarde kan op de condensor worden afgedrukt. Een standaard dia is 1,2 mm dik, maar dia’s, zelfs uit dezelfde doos, variëren in dikte. De dia mag niet meer dan ± zijn 0,05 mm van de aanbevolen dikte.

U kunt de juiste schuifdikte bepalen voor uw condensor op de volgende manier:

1. Plaats, met de condensor in de bovenste stand, een glaasje, met aan één kant bevroren één kant, in oliecontact met de condensor – matte kant naar het objectief gericht.
2. Onderzoek het matte oppervlak met een objectief met laag vermogen (bijv. 10 X).
3. Als de afbeelding een heldere vlek met een zwart midden vertoont, is de dia ofwel te dik ofwel te dun. Als er maar een klein lichtpuntje is, heeft het glaasje de juiste dikte.
4. Als de schuif niet correct is, probeer dan de condensor te laten zakken. Als het zwarte centrum verdwijnt en er blijft een klein lichtpuntje over, de dia is te dun; anders is de dia te dik.
5. Controleer de dikte van het objectglaasje met een micrometer en herhaal dit proces met objectglaasjes van verschillende diktes totdat de optimale dikte is gevonden.

Centreren van de donkerveldcondensor

Als u een universele condensor gebruikt, centreer deze dan voor Köhler-verlichting in

helder veld zou voldoende moeten zijn voor gebruik in de donkere veldopstelling. Als u een hoge NA donkerveldcondensor gebruikt, gebruikt u de volgende procedure:

1. Selecteer een objectief met een zeer lage vergroting (bijv. 2x of 5x).
2. Zorg voor alle mogelijke verlichting.
3. Smeer de condensor in en breng hem naar de bovenste positie onder een blinde schuif.
4. Als de condensor een kleine centrale heldere ring heeft, focus de microscoop dan op deze ring en centreer het met behulp van de centreerknoppen van de condensor. Dit is een spotringcondensor.
5. Als er geen beeld is, voert u de volgende stappen uit:
   1. Gebruik een glaasje van de juiste dikte waarvan één kant aan één kant gematteerd is.
   1. Olie de niet-matte kant naar de condensor.
   1. Centreer de heldere lichtvlek met de centreerschroeven van de condensor. Sommige lichte aanpassing met de centreerschroeven kan nodig zijn bij het overschakelen naar de hoge NA objectieven.
6. Ervan uitgaande dat uw microscoopglaasjes  allemaal dezelfde dikte hebben, mag  u de positie van de condensor niet verticaal verplaatsen.

Scherpstellen in donker veld bij hoge NA

Bij sterke vergroting en hoge NA kan het in eerste instantie niet gemakkelijk zijn om scherp te stellen op de exemplaar omdat het veld donker is. Dit geldt vooral als het exemplaar erg schaars is. In het geval van een zeer verspreid exemplaar, een waspotloodmarkering op de monsterzijde van de dia is een handig referentiepunt voor de eerste scherpstelling. De volgende procedure zal hulp bij het focussen:

1. Olie de condensor op de slede
2. Verlaag het platform (of verhoog het objectief) en olie de bovenkant van de glijbaan
3. Verhoog het platform (of verlaag het objectief) totdat het objectief en de olie elkaar net raken
4. Kijk in de microscoop – je zou een diffuus helder veld moeten zien
5. Stel eerst scherp door de afstand tussen de dia en de objectieflens te vergroten (in het geval dat je bent al te dichtbij) en dan minderen. Naarmate je de focus nadert, zal het veld worden heel helder dan grijs dan zwart
6. Bij focus zal het veld zwart zijn en zal het preparaat glanzen.

Oefening

1. Gebruik een vel lenspapier om de verlichting te observeren die wordt uitgezonden door een donker veld met laag vermogen condensator. Plaats het papier op het oppervlak van de condensor en til het papier geleidelijk op terwijl u de verlichting erop observeert. Probeer ook eens een witte kaart op de rand bovenop te leggen de condensator. Beschrijf wat je ziet.
2. Kijk naar een preparaat van een wangcel door middel van een donker veld. Hoe verhoudt het zich tot helder veld?  Kun je de ribbels op het celoppervlak onderscheiden?
3. Maak een donkerveldcondensor met lage vergroting met behulp van een schijf op een helderveld condensator. Was je succesvol?