We weten allemaal dat sterren gemakkelijker te zien zijn tegen de donkere achtergrond van de nacht dan tegen de heldere hemel van de dag. Wist u ook dat hetzelfde geldt voor uw microscoopmonster? Donkerveldmicroscopie is een populaire microscooptechniek waarmee uw ongekleurde transparante preparaten er helder uitzien tegen een donkere achtergrond.
Hoe verschilt donkerveld van conventionele microscopie?
Bij conventionele helderveldverlichting wordt uw preparaat belicht vanuit een centrale lichtbron (u kunt meer lezen over helderveldmicroscopie in dit Bitesize Bio-artikel). Dit resulteert in een groot contrastbeeld. Bij donkerveldmicroscopie wordt deze lichtbron echter geblokkeerd door een condensor of een ‘stop’ onder het podium. Deze condensor of stop verstrooit het licht waardoor alleen schuine stralen kunnen reflecteren en breken van uw exemplaar, wat op zijn beurt een helder beeld creëert op een donkere achtergrond.
Wat heeft mijn telescoop nodig om donkerveld te doen?
De meeste stereo- en samengestelde microscopen kunnen donkerveldbeeldvorming uitvoeren. Controleer de specificaties van uw microscoop om te zien of dit bij u het geval is. Als uw microscoop geen ingebouwde condensor of stop heeft, hoeft u zich geen zorgen te maken, u kunt uw microscoop waarschijnlijk nog steeds gebruiken voor donkerveldbeeldvorming. U zou een aftermarket-condensor moeten kunnen kopen of zelfs uw eigen stop kunnen maken. Lees hieronder voor meer informatie over condensors en stops.
Condensatoren
In een donkerveldopstelling is een Abbe-donkerveldcondensor onder de microscooptafel gemonteerd. Dit regelt het licht voordat het uw preparaat en objectief binnendringt. Het bestaat uit twee ongecorrigeerde lenzen en een irisdiafragma. De bovenste lens van een Abbe-donkerveldcondensor is concaaf, daarom vormt het licht dat uit deze bovenste lens komt een omgekeerde holle lichtkegel. Vervolgens bereiken alleen schuine lichtstralen uw preparaat. Als de numerieke apertuur van uw condensor groter is dan uw objectief, zullen deze schuine lichtstralen uw objectief kruisen en missen, waardoor de achtergrond donker lijkt terwijl ze reflecteren en breken van uw exemplaar. U kunt uw condensor op twee verschillende manieren aanpassen voor optimale helderheid, contrast, scherptediepte, enz.:
1) Door hem dichter of verder weg van het preparaat en de tafel te plaatsen
2) door de iris of het diafragma te openen of te sluiten.
Stops
Stops zijn ondoorzichtige schijven die zich net onder de onderste lens van de substage condensor bevinden. Bij gebruik van stops moeten zowel het diafragma als het velddiafragma wijd worden geopend om schuine stralen rond de stop te laten diffunderen en uw preparaat te bereiken. (Denk aan een zonsverduistering, waarbij de maan de aarde/het monster blokkeert tegen direct licht.) U kunt voor bijna elke telescoop stops kopen, of zelfs uw eigen maken door een muntstuk (of andere ondoorzichtige schijf) op een helder glas te monteren schijf.
Wanneer is donkerveld goed te gebruiken?
Donkerveld is handig wanneer u ongekleurde, transparante exemplaren wilt bekijken. De beste exemplaren voor donkerveld moeten een brekingsindex hebben die dicht bij de omgeving ligt en anders moeilijk in beeld te brengen is met conventionele helderveldmicroscopie. Veel kleine waterorganismen hebben bijvoorbeeld brekingsindices die erg lijken op het omringende water, waardoor ze ideale kandidaten zijn voor donkerveldmicroscopie. Andere ideale biologische kandidaten zijn onder meer diatomeeën, kleine insecten, ongekleurde levende bacteriën, gist, weefselkweekcellen, enz. Niet-biologische kandidaten zijn onder meer minerale en chemische kristallen en dunne delen van polymeren.
Wat zijn de problemen met donker veld?
Hoewel donkerveld onder de juiste omstandigheden prachtige beelden kan opleveren, zijn er een aantal nadelen aan donkerveldmicroscopie:
- Donker veld heeft een intense hoeveelheid licht nodig om te werken. Dit intense licht kan verblinding en vervorming veroorzaken. Daarom creëert een donker veld geen betrouwbare monstermetingen.
- Donker veld is gevoelig voor verontreinigingen. U moet zorgvuldig te werk gaan bij het reinigen van uw objectglaasjes en alle optische oppervlakken wanneer u donkerveldbeeldvorming uitvoert, aangezien elk vuiltje wil oplichten bij gebruik van donkerveld. U moet ook voorzichtig zijn bij het voorbereiden van uw monsters, aangezien eventuele verontreinigingen (stof, luchtbellen, enz.) in uw montage, boven of onder het vlak van focus, uw afbeelding kunnen aantasten.
- Monsters die niet dun genoeg zijn, zijn vatbaar voor degradatie en vervorming. De beste donkerveldmonsters moeten dun zijn om diffractie-artefacten te verminderen.
Vanwege de beperkingen van donkerveldmicroscopie en recente ontwikkelingen in microscopietechnieken (zoals fasecontrast en DIC) wordt donkerveld niet vaak gebruikt in moderne beeldvorming. Het donkere veld wint echter weer aan populariteit omdat het wordt gecombineerd met andere technieken zoals fluorescentiemicroscopie.